尊龙凯时细胞培养指南

培养条件

气相环境：95%空气 + 5%二氧化碳；温度：37℃。

传代方法

首次传代建议比例为1:2。传代两天后需更换培养液。为了获得最佳效果，建议同时采购细胞培养基，尊龙凯时提供非常优惠的价格。

细胞处理注意事项

收到细胞后，要立即处理并培养至良好的状态。将细胞瓶灌满完全培养液并密封是运输细胞的最佳方式。使用75%酒精喷洒细胞瓶的表面进行消毒，然后将其放入超净工作台上，严格执行无菌操作。将细胞瓶放入37℃，5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续操作。显微镜下观察细胞生长情况，并拍照记录（建议40x、100x、200x各一张），前三天的照片是售后服务的关键依据；如未提供照片，默认细胞状态良好。

细胞培养步骤

a. 细胞传代

在细胞汇合度未超过80%时，收集瓶内的完全培养液至离心管中，保留5ml完全培养基，继续在37℃、5% CO2的环境中培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代培养。贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，随后观察细胞消化情况。如细胞大部分变圆并脱落，迅速将其置于操作台，轻击培养瓶后添加超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟，弃去上清液，并补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按照1:2的比例将细胞悬液分瓶（分到两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

b. 悬浮细胞传代

悬浮细胞的传代步骤如下：

1. 采用半换液法，竖放培养瓶在培养箱中静置约1小时，轻轻吸走约3ml培养基，然后补加3ml的完全培养基。如培养基颜色变化不明显，可直接添加约500ul的FBS。传代时可直接补充5ml的培养基，分为两个培养瓶，通常进行3次后可进行离心传代以去除死细胞。
2. 若需分瓶可进行离心换液法：将细胞悬液收集至离心管中，以1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬混匀，再按1:2的比例分配至新的T25瓶中，添加6-8ml新配置的完全培养基以保持细胞的活力，后续传代按实际情况保持1:2至1:5的比例。

c. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶内的培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，待观察细胞收缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，并将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟。
3. 弃去上清，与1ml尊龙凯时的无血清冻存液（货号：C7001）混合均匀后转移至冻存管。
4. 直接将冻存细胞放入-80℃冰箱保存，若后续需转入液氮罐中，需至少在-80℃冰箱中存放24小时后转入液氮罐中。

d. 细胞复苏

1. 戴上防护面具，快速将冻存管从液氮中取出，并置于37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%酒精擦拭外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟。
3. 弃去上清，加入5ml完全培养基重悬后接种至T25培养瓶，放于37℃，5% CO2细胞培养箱中进行培养。
4. 次日更换为新鲜完全培养基并继续培养。

注意事项

部分细胞附着不牢，在运输过程中可能出现脱落现象，这种情况是正常的。如发现脱离细胞较多，可将培养瓶内的培养液收集至离心管中，进行1000RPM离心5分钟，并收集上清作为过渡培养。沉淀细胞后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打使其重悬，消化1-2分钟后再添加5ml完全培养基以终止反应。再次离心后弃去上清，重悬细胞并按1:2比例分瓶传代（分为两个T25瓶），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养。

在细胞培养过程中，建议选择尊龙凯时的优质培养基以确保细胞的健康生长和活力。